L’optique adaptative permet d’augmenter la résolution de la microscopie
Les astronomes utilisent depuis longtemps la technique connue sous le nom d’optique adaptative (OA) pour atteindre la résolution maximale de certains de leurs télescopes. Dans ce but, on mesure la distorsion apportée à la lumière par l’atmosphère et ses turbulences, et on applique à l’image brute la correction correspondante.
En microscopie, on a essayé ces méthodes pour obtenir de meilleures images d’échantillons biologiques mais leur complexité, leur coût et leur lenteur ont fait renoncer à leur emploi.
Des scientifiques de l’Howard Hughes Medical Institute, Ashburn, Virginia, USA, du National Institute of Health, Bethesda, Maryland , USA, de l’University of Chicago, Chicago, Illinois, USA, du Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts, USA et de la Zhejiang University, Hangzhou, China ont adapté à la microscopie une des méthodes utilisée en astronomie, la diversité de phase.
La pierre angulaire de l’OA est la détection (en anglais le « sensing » ) du front d’onde déformé par les diverses aberrations.
En astronomie, on utilise souvent une méthode directe qui consiste à mesurer l’aberration affectant l‘image d’une étoile fixe proche de la cible ou encore sur celle d’une étoile artificielle créée dans la haute atmosphère (entre 80 et 100 km), par l’excitation d’atomes de sodium par un puissant laser. Ces méthodes sont difficiles à transposer en microscopie où il est plus simple d’utiliser une méthode indirecte comme la diversité de phase (Fig.1.).
D&ns cette méthode appliquée par les chercheurs à la microscopie par fluorescence, on prend , outre l’image de l’objet obérée par les aberrations, une séquence d’images supplémentaires avec une diversité d’aberrations ajoutées à dessein grâce à l’élément adaptatif, le miroir déformable. L’ensemble de ces images » de diversité de phase » fournit une information supplémentaire permettant d’estimer l’aberration inconnue. Cette approche indirecte présente comme avantages un coût relativement bas, un montage optique simple puisqu’il ne nécessite pas de détecteur de front d’onde supplémentaire, une vitesse plus élevée ainsi qu’une amélioration de la performance dans les tissus biologiques épais.
La figure 1.ci-dessous résume cette approche.
Fig.1. Détection (sensing) des fronts d’onde soumis à des aberrations en microscopie à fluorescence. a) -A gauche : dans un échantillon fluorescent idéal, les fronts d’onde sphériques sont convertis en fronts d’onde plans parallèles par l’objectif (OBJ). – A droite : dans la plupart des échantillons réfringents réels, on a un front d’onde distordu avec des variations de phase distinguables au niveau de la pupille de l’observateur. b) La technique du sensing indirect utilise le même trajet optique que celui de l’image fluorescente et emploie des algorithmes pour analyser le front d’onde de nombreuses images fluorescentes successives de l’échantillon. c) Dans la méthode de diversité de phase, on collecte plusieurs images d1,……dk avec une diversité d’aberrations connues θ1,……θk. L’ensemble des images de diversité d1,……dk fournit une information supplémentaire qui permet d’estimer l’aberration inconnue φ. Tiré de Phase-diversity-based wavefront sensing for fluorescence microscopy: COURTNEY JOHNSON, MIN GUO, MAGDALENA C. SCHNEIDER, YIJUN SU, SATYA KHUON, NIKOLAJ REISER, YICONG WU, PATRICK LA RIVIERE, AND HARI SHROFF Vol. 11, No. 6 / June 2024 / Optica Open access
Le but de l’algorithme de diversité de phase est, à partir des images d’entrée, des fronts d’onde de diversités correspondantes connus et des paramètres du système, d’obtenir l’estimation la plus précise possible du front d’onde inconnu responsable des aberrations.
Le miroir déformable (disponible commercialement) est constitué d’une membrane réfléchissante déformable sur laquelle agissent 52 actionneurs électromagnétiques. Il est calibré de façon à connaître l’effet sur le front d’onde de chaque actionneur pour une tension appliquée donnée.
La figure ci-dessous est un schéma plus détaillé du système optique utilisé.
Fig.2. Optique adaptative à grand champ pour microscopie à fluorescence
Le faisceau d’un laser à 488 nm (bleu) est agrandi par un expanseur de faisceau. Il est réfléchi par un miroir didchroïque et focalisé par une lentille L1 sur le plan focal d’un objectif de microscope de grossissement 60. Il illumine ainsi un échantillon fluorescent. La lumière fluorescente (verte) passe à travers l’objectif et la lentille L1 et est séparée de la lumière bleue d’illumination par passage à travers le miroir dichroïque. Elle est alors agrandie et envoyée sur le miroir déformable. Une caméra CCD à multiplication d’électrons effectue la détection finale de l’image.
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La figure suivante illustre le mode de correction des aberrations sur des images de cellules issues d’une lignée cellulaire tumorale appelée U2OS et de la lignée PtK2.
Fig. 3. Echantillons biologiques observés à l’aide d’une optique adaptative utilisant la diversité de phase
Les images des 3 colonnes correspondent successivement à l’objet original pour la première colonne { a), e), m) }, aux images obtenues sans correction des aberrations pour la deuxième colonne { b), f),n) }, enfin à celles { c), g), o) } obtenues avec correction des aberrations par l’optique adaptative .
– a), b), c) Des cellules U2OS ont été fixées et colorées pour mettre en évidence des microtubules. Des détails invisibles sur l’image b) obérée par les aberrations sont parfaitement perçus sur l’image c) corrigée. La barre de mesure vaut 10 μm
-e), f), g) A plus fort grossissement, vues de la région encadrée par un rectangle rouge sur les images a), b), c) . La barre de mesure vaut 2 μm
-m), n), o) Vues de cellules de la lignée Ptk2 vues à un plus grand grossissement.
La barre de mesure vaut 2 μm
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L »optique adaptative par diversité de phase permet ainsi d’arriver quasiment à la résolution nominale de l’objectif .
La microscopie par fluorescence constitue un outil de grande valeur pour la biologie . Cependant ses performances sont compromises par les distortions dues aux imperfections optiques propres à la nature réfringente des échantillons biologiques . Les images sont ainsi dégradées, leur contraste et leur résolution affaiblis. Les méthodes de l’optique adaptative des astronomes peuvent détecter l’aberration du front d’onde, mais elles sont compliquées, peu efficaces, lentes et trop onéreuses pour devenir une routine pour la plupart des laboratoires utilisant la microscopie.
La méthode basée sur la diversité de phase fournit une mesure du front d’onde avec une erreur inférieure à λ/35 avec relativement peu de mesures. Tout ceci avec l’addition d’un seul élément supplémentaire, le miroir déformable.
Elle est destinée à se répandre dans de nombreux laboratoires de biologie.
Pour en savoir plus :
Phase-diversity-based wavefront sensing for fluorescence microscopy: COURTNEY JOHNSON, MIN GUO, MAGDALENA C. SCHNEIDER, YIJUN SU, SATYA KHUON, NIKOLAJ REISER, YICONG WU, PATRICK LA RIVIERE, AND HARI SHROFF Vol. 11, No. 6 / June 2024 / Optica
